Severinov Laboratory

AboutTeamPublicationsFundingThesis defencesCourses

Start date – March 2013

Research in Severinov lab involves three main directions, CRISPR-Cas systems, bacteriophages, and antibiotics.

Bacterial viruses, bacteriophages, are most abundant and diverse live objects on our planet. They evolved a trove of mechanisms to destroy bacteria. Bacteriophages can also be used directly as antibacterial agents. We identify new bacteriophages from environment, determine their genomic sequences and identify molecular mechanisms that they use to effectively infect bacterial hosts. The knowledge gained produces targets for future development of antibacterial drugs.

Adaptive bacterial immunity CRISPR-Cas systems have revolutionized the field of genomic editing and opened up possibilities for genomic medicine. In collaboration with laboratories from NIH and MIT we predict and functionally characterize new CRISPR-Cas systems that may have advantages over existing ones in practical applications. We also study the biological role of various CRISPR-Cas systems, trying to understand how they shape the interactions of bacteria with mobile genetic elements such as bacteriophages and impact bacterial ecology and evolution. To this end, we a combination of advanced biochemical, genetic, biophysical and bioinformatics methods.

Antibiotic resistance becomes a global healthcare problem that may undermine the humankind ability to control bacterial diseases. We use bioinformatics to search for new antibiotics by mining available genomic and metagenomic data and we experimentally validate predicted antibiotic biosynthesis clusters and characterise new antibiotics they encode. We determine the structures of validated compounds, mechanisms of their biosynthesis and action on sensitive cells. The knowledge gained is used to create semisynthetic bioactive compounds that can be developed for practical use in medicine and agriculture.

Virus-borne mini-CRISPR arrays are involved in interviral conflicts. Medvedeva S, Liu Y, Koonin E, Severinov K, Prangishvili D, Krupovic M. Nat Commun. 15.11.2019; 10(1):5204. doi: 10.1038/s41467-019-13205-2.

Genome Maintenance Proteins Modulate Autoimmunity Mediated Primed Adaptation by the Escherichia coli Type I-E CRISPR-Cas System. Kurilovich E, Shiriaeva A, Metlitskaya A, Morozova N, Ivancic-Bace I, Severinov K, Savitskaya E. Genes (Basel). 31.10.2019; 10(11). pii: E872. doi: 10.3390/genes10110872.

Risk stratification of cervical lesions using capture sequencing and machine learning method based on HPV and human integrated genomic profiles. Tian R, Cui Z, He D, Tian X, Gao Q, Ma X, Yang J, Wu J, Das B, Severinov K, Hitzeroth I, Debata P, Xu W, Zhong H, Fan W, Chen Y, Jin Z, Cao C, Yu M, Xie W, Huang Z, Bao Y, Xie H, Yao S, Hu Z. Carcinogenesis. 16.10.2019; 40(10):1220-1228. doi: 10.1093/carcin/bgz094.

Detection of spacer precursors formed in vivo during primed CRISPR adaptation. Shiriaeva A, Savitskaya E, Datsenko K, Vvedenskaya I, Fedorova I, Morozova N, Metlitskaya A, Sabantsev A, Nickels B, Severinov K, Semenova E Nat Commun. 10.10.2019; 10(1):4603. doi: 10.1038/s41467-019-12417-w.

Structure of ribosome-bound azole-modified peptide phazolicin rationalizes its species-specific mode of bacterial translation inhibition. Travin D, Watson Z, Metelev M, Ward F, Osterman I, Khven I, Khabibullina N Serebryakova M, Mergaert P, Polikanov Y, Cate J, Severinov K. Nat Commun. 08.10.2019; 10(1):4563. doi: 10.1038/s41467-019-12589-5

Using an Endogenous CRISPR-Cas System for Genome Editing in the Human Pathogen Clostridium difficile. Maikova A, Kreis V, Boutserin A, Severinov K, Soutourina O; Appl Environ Microbiol. 01.10.2019; 85(20). pii: e01416-19. doi: 10.1128/AEM.01416-19.

Systematic prediction of functionally linked genes in bacterial and archaeal genomes. Shmakov S, Faure G, Makarova K, Wolf Y, Severinov K, Koonin E. Nat Protoc. 01.10.2019; (10):3013-3031. doi: 10.1038/s41596-019-0211-1.

Efficient in vivosynthesis of lasso peptide pseudomycoidin proceeds in the absence of both the leader and the leader peptidase. Zyubko T, Serebryakova M, Andreeva J, Metelev M, Lippens G, Dubiley S, Severinov K Chemical Science. 08.2019.

Structural Basis of Leader Peptide Recognition in Lasso Peptide Biosynthesis Pathway. Sumida T, Dubiley S, Wilcox B, Severinov K, Tagami S. ACS Chem Biol. 19.07.2019; 14(7):1619-1627. doi: 10.1021/acschembio.9b00348.

Cytological Immunostaining of HMGA2, LRP1B, and TP63 as Potential Biomarkers for Triaging Human Papillomavirus-Positive Women.. Jiang Y, Zhu C, He D, Gao Q, Tian , Ma X, Wu J, Das BC, Severinov K, Hitzeroth I, Debata P, Liu R, Zou L, Shi L, Xu H, Wang K, Bao Y, Ka-Kit LR, You Z, Cui Z, Hu Z; Transl Oncol; 01.07.2019; 12(7):959-967. doi: 10.1016/j.tranon.2019.04.012.

Natural diversity of CRISPR spacers of Thermus: evidence of local spacer acquisition and global spacer exchange.Lopatina A, Medvedeva S, Artamonova D, Kolesnik M, Sitnik V, Ispolatov Y, Severinov K. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 13.05.2019 13;374(1772):20180092. doi: 10.1098/rstb.2018.0092.

Reiterative Synthesis by the Ribosome and Recognition of the N-Terminal Formyl Group by Biosynthetic Machinery Contribute to Evolutionary Conservation of the Length of Antibiotic Microcin C Peptide PrecursorZukher I, Pavlov M, Tsibulskaya D, Kulikovsky A, Zyubko T, Bikmetov D, Serebryakova M, Nair S, Ehrenberg M, Dubiley S, Severinov K. 30.04.2019;10(2). pii: e00768-19. doi: 10.1128/mBio.00768-19.

Systematic analysis of Type I-E Escherichia coli CRISPR-Cas PAM sequences ability to promote interference and primed adaptation.Musharova O, Sitnik V, Vlot M, Savitskaya E, Datsenko K Krivoy A, Fedorov I, Semenova E, Brouns S, Severinov K, Mol Microbiol.04.2019; 111(6):1558-1570. doi: 10.1111/mmi.14237.

Systematic analysis of Type I-E Escherichia coli CRISPR-Cas PAM sequences ability to promote interference and primed adaptation.Musharova O, Sitnik V, Vlot M, Savitskaya E, Datsenko K, Krivoy A, Fedorov I, Semenova E, Brouns S Severinov K. Mol Microbiol. 15.03.2019. doi: 10.1111/mmi.14237.

Xenogeneic Regulation of the Bacterial Transcription Machinery.Tabib-Salazar A, Mulvenna N, Severinov K, Matthews S, Wigneshweraraj S J Mol Biol.02.2019. pii: S0022-2836(19)30085-3. doi: 10.1016/j.jmb.2019.02.008.

Cryo-EM structure and in vitro DNA packaging of a thermophilic virus with supersized T=7 capsids.Bayfield O, Klimuk E, Winkler D, Hesketh E, Chechik M, Cheng N, Dykeman E, Minakhin L, Ranson N, Severinov K, Steven A, Antson A. Proc Natl Acad Sci USA02.2019;116(9):3556-3561. doi: 10.1073/pnas.1813204116.

Architecture of Microcin B17 Synthetase: An Octameric Protein Complex Converting a Ribosomally Synthesized Peptide into a DNA Gyrase Poison. Ghilarov D, Stevenson C², Travin D, Piskunova J, Serebryakova M, Maxwell A, Lawson D, Severinov K.Mol Cell. 2019 Feb 21;73(4):749-762.e5. doi: 10.1016/j.molcel.2018.11.032. Epub 2019 Jan 17.

Structure Studies of the CRISPR-Csm Complex Reveal Mechanism of Co-transcriptional InterferenceYou L, Ma J, Wang J, Artamonova D, Wang M, Liu L, Xiang H, Severinov K, Zhang X, Wang Y Cell01.2019, pii: S0092-8674(18)31451-X. doi: 10.1016/j.cell.2018.10.052.

BREX system of Escherichia coli distinguishes self from non-self by methylation of a specific DNA site.Gordeeva J, Morozova N, Sierro N, Isaev A, Sinkunas T, Tsvetkova K, Matlashov M, Truncaite L, Morgan R, Ivanov N, Siksnys V, Zeng L, Severinov K. Nucleic Acids Res. 01.2019; doi: 10.1093/nar/gky1125.

Single-nucleotide-resolution mapping of DNA gyrase cleavage sites across the Escherichia coli genome.Sutormin D, Rubanova N, Logacheva M, Ghilarov D, Severinov K. Nucleic Acids Res. 01.2019 doi: 10.1093/nar/gky1222.

Effects of Population Dynamics on Establishment of a Restriction-Modification System in a Bacterial Host Graovac S, Rodic A, Djordjevic M,Severinov K, Djordjevic M 07.01.2019;24(1). pii: E198. doi: 10.3390/molecules24010198.

Ultrahigh-throughput functional profiling of microbiota communities. Terekhov S, Smirnov I, Malakhova M, Samoilov A, Manolov A, Nazarov A, Danilov D, Dubiley S, Osterman I, Rubtsova M, Kostryukova E, Ziganshin R, Kornienko M, Vanyushkina A, Bukato O, Ilina E, Vlasov V, Severinov K, Gabibov A, Altman S. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018 Sep 4. doi: 10.1073/pnas.1811250115.

Comparative genomics and evolution of trans-activating RNAs in Class 2 CRISPR-Cas systems. Faure G, Shmakov S, Makarova K, Wolf Y, Crawley A, Barrangou R, Koonin E. RNA Biol., 2018 Aug 14:1-14. doi: 10.1080/15476286.2018.1493331.

Escherichia coli ItaT is a type II toxin that inhibits translation by acetylating isoleucyl-tRNAIle. Wilcox B, Osterman I, Serebryakova M, Lukyanov D, Komarova E, Gollan B, Morozova N, Wolf YI, Makarova KS, Helaine S, Sergiev P, Dubiley S, Borukhov S, Severinov K. Nucleic Acids Res. 2018 Jun 21. doi: 10.1093/nar/gky560.

Systematic prediction of genes functionally linked to CRISPR-Cas systems by gene neighborhood analysis. Shmakov S, Makarova K, Wolf Y, Severinov K, Koonin E. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Jun 5;115(23):E5307-E5316. doi: 10.1073/pnas.1803440115. Epub 2018 May 21.

Defining the Seed Sequence of the Cas12b CRISPR-Cas Effector Complex. Jain I, Minakhin L, Mekler V, Sitnik V, Rubanova N, Severinov K, Semenova E. RNA Biol. 2018 Jul 19. doi: 10.1080/15476286.2018.1495492.

A Thermus phage protein inhibits host RNA polymerase by preventing template DNA strand loading during open promoter complex formation. WY O, Murayama Y, Mekler V, Minakhin L, Severinov K, Yokoyama S, Sekine S. Nucleic Acids Res. 2018 Jan 9;46(1):431-441. doi: 10.1093/nar/gkx1162. PMID: 29165680

Biosynthesis of Translation Inhibitor Klebsazolicin Proceeds through Heterocyclization and N-Terminal Amidine Formation Catalyzed by a Single YcaO Enzyme. Travin D, Metelev M, Serebryakova M, Komarova E, Osterman I, Ghilarov D, Severinov K. J Am Chem Soc. 2018 Apr 11. doi: 10.1021/jacs.8b02277. PMID: 29601195
Primed CRISPR adaptation in Escherichia coli cells does not depend on conformational changes in the Cascade effector complex detected in Vitro. Krivoy A, Rutkauskas M, Kuznedelov K, Musharova O, Rouillon C, Severinov K, Seidel R. Nucleic Acids Res. 2018 Mar 27. doi: 10.1093/nar/gky219. PMID:29596641

A non-canonical multisubunit RNA polymerase encoded by the AR9 phage recognizes the template strand of its uracil-containing promoters. Sokolova M, Borukhov S, Lavysh D, Artamonova T, Khodorkovskii M, Severinov K. Nucleic Acids Res. 2017 Jun 2;45(10):5958-5967. doi: 10.1093/nar/gkx264. PubMed PMID: 28402520.

Mechanism of duplex DNA destabilization by RNA-guided Cas9 nuclease during target interrogation. Mekler V, Minakhin L, Severinov K. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 May 23;114(21):5443-5448. doi: 10.1073/pnas.1619926114. Epub 2017 May 8. PubMed PMID: 28484024.

Peptide-nucleotide antibiotic Microcin C is a potent inducer of stringent response and persistence in both sensitive and producing cells. Piskunova J, Maisonneuve E, Germain E, Gerdes K, Severinov K. Mol Microbiol. 2017 May;104(3):463-471. doi: 10.1111/mmi.13640. Epub 2017 Feb 24. PubMed PMID: 28164379.

Viral genome packaging terminase cleaves DNA using the canonical RuvC-like two-metal catalysis mechanism. Xu R, Jenkins H, Chechik M, Blagova E, Lopatina A, Klimuk E, Minakhin L, Severinov K, Greive S, Antson A. Nucleic Acids Res. 2017 Apr 7;45(6):3580-3590. doi: 10.1093/nar/gkw1354. PubMed PMID: 28100693; PubMed Central PMCID: PMC5389553.

Spacer-length DNA intermediates are associated with Cas1 in cells undergoing primed CRISPR adaptation. Musharova O, Klimuk E, Datsenko A, Metlitskaya A, Logacheva M, Semenova E, Severinov K, Savitskaya E. Nucleic Acids Res. 2017 Apr 7;45(6):3297-3307. doi: 10.1093/nar/gkx097. PubMed PMID: 28204574; PubMed Central PMCID: PMC5389516.

Dynamics of Escherichia coli type I-E CRISPR spacers over 42 000 years. Savitskaya E, Lopatina A, Medvedeva S, Kapustin M, Shmakov S, Tikhonov A, Artamonova I, Logacheva M, Severinov K. Mol Ecol. 2017 Apr;26(7):2019-2026. doi: 10.1111/mec.13961. Epub 2017 Jan 17. PubMed PMID: 27997045.

Acinetodin and Klebsidin, RNA Polymerase Targeting Lasso Peptides Produced by Human Isolates of Acinetobacter gyllenbergii and Klebsiella pneumoniae. Metelev M, Arseniev A, Bushin L, Kuznedelov K, Artamonova T, Kondratenko R, Khodorkovskii M, Seyedsayamdost M, Severinov K. ACS Chem Biol. 2017 Mar 17;12(3):814-824. doi: 10.1021/acschembio.6b01154. Epub 2017 Feb 3. PubMed PMID: 28106375.

Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Shmakov S, Smargon A, Scott D, Cox D, Pyzocha N, Yan W, Abudayyeh O, Gootenberg J, Makarova KS, Wolf Y, Severinov K, Zhang F, Koonin E. Nat Rev Microbiol. 2017 Mar;15(3):169-182. doi: 10.1038/nrmicro.2016.184. Epub 2017 Jan 23. PubMed PMID: 28111461.

The action of Escherichia coli CRISPR-Cas system on lytic bacteriophages with different lifestyles and development strategies.Strotskaya A, Savitskaya E, Metlitskaya A, Morozova N, Datsenko K, Semenova E, Severinov K. Nucleic Acids Res. 2017 Feb 28;45(4):1946-1957. doi: 10.1093/nar/gkx042. PubMed PMID: 28130424; PubMed Central PMCID: PMC5389539.

Transcription Profiling of Bacillus subtilis Cells Infected with AR9, a Giant Phage Encoding Two Multisubunit RNA Polymerases. Lavysh D, Sokolova M, Slashcheva M, Förstner K, Severinov K. MBio. 2017 Feb 14;8(1). pii: e02041-16. doi: 10.1128/mBio.02041-16. PubMed PMID: 28196958; PubMed Central PMCID: PMC5312081.

Klebsazolicin inhibits 70S ribosome by obstructing the peptide exit tunnel. Metelev M, Osterman I, Ghilarov D, Khabibullina N, Yakimov A, Shabalin K, Utkina I, Travin D, Komarova E, Serebryakova M, Artamonova T, Khodorkovskii M, Konevega A, Sergiev P, Severinov K, Polikanov Y. Nat Chem Biol. 2017 Aug 28. doi: 10.1038/nchembio.2462. PMID: 28846667

Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 through autonomous processing of a single crRNA array. Zetsche B, Heidenreich M, Mohanraju P, Fedorova I, Kneppers J, DeGennaro E, Winblad N, Choudhury S, Abudayyeh O, Gootenberg J, Wu W, Scott D, Severinov K, Oost J, Zhang F. Nature Biotechnology, 2017 35, 31-34 (2017) doi:10.1038/nbt.3737.

Novel Fri1-like Viruses Infecting Acinetobacter baumannii-vB_AbaP_AS11 and vB_AbaP_AS12-Characterization, Comparative Genomic Analysis, and Host-Recognition Strategy. Popova A, Lavysh D, Klimuk E, Edelstein M, Bogun A, Shneider M, Goncharov A, Leonov S, Severinov K. Viruses. 2017 Jul 17;9(7). pii: E188. doi: 10.3390/v9070188. PMID:28714913

Hypoxic renal injury in newborns with abdominal compartment syndrome (clinical and experimental study). Morozov D, Morozova O, Pervouchine D, Severgina L, Tsyplakov A, Zakharova N, Sushentsev N, Maltseva L, Budnik I. Pediatr Res. 2017 Nov 15. doi: 10.1038/pr.2017.263. PMID: 29053704

Optimal number of spacers in CRISPR arrays. Martynov A, Severinov K, Ispolatov I. PLoS Comput Biol. 2017 Dec 18;13(12):e1005891. doi: 10.1371/journal.pcbi.1005891. eCollection 2017 Dec.

The Origins of Specificity in the Microcin-Processing Protease TldD/E. Ghilarov D, Serebryakova M, Stevenson C, Hearnshaw S, Volkov D, Maxwell A, Lawson D, Severinov K. Structure. 2017 Oct 3;25(10):1549-1561.e5. doi: 10.1016/j.str.2017.08.006. Epub 2017 Sep 21.

Features of CRISPR-Cas Regulation Key to Highly Efficient and Temporally-Specific crRNA Production. Rodic A, Blagojevic B, Djordjevic M, Severinov K, Djordjevic M. Front Microbiol. 2017 Nov 3;8:2139. doi: 10.3389/fmicb.2017.02139. eCollection 2017.

The Product of Yersinia pseudotuberculosis mcc Operon Is a Peptide-Cytidine Antibiotic Activated Inside Producing Cells by the TldD/E Protease. Tsibulskaya D, Mokina O, Kulikovsky A, Piskunova J, Severinov K, Serebryakova M, Dubiley S. Chem Soc. 2017 Nov 15;139(45):16178-16187. doi: 10.1021/jacs.7b07118. Epub 2017 Oct 31.

The CRISPR Spacer Space Is Dominated by Sequences from Species-Specific Mobilomes. Shmakov S, Sitnik V, Makarova K, Wolf Y, Severinov K, Koonin E. MBio. 2017 Sep 19;8(5). pii: e01397-17. doi: 10.1128/mBio.01397-17.PMID:28928211

Come Together: CRISPR-Cas Immunity Senses the Quorum. Semenova E, Severinov K. Molecular Cell 64, December 15, 2016, Pages 1102-1108.

A Trojan-horse peptide-carboxymethyl-cytidine antibiotic from Bacillus amyloliquefaciens. Serebryakova M, Tsibulskaya D, Mokina O, Kulikovsky A, Nautiyal M, Van Aerschot A , Severinov K, DubileyS. J. Am. Chem. Soc., 2016, 138(48), pp. 15690-15698 DOI: 10.1021/jacs.6b09853

Altered stoichiometry Escherichia coli Cascade complexes with shortened CRISPR RNA spacers are capable of interference and primed adaptation Kuznedelov K, Mekler V, Lemak S, Tokmina-Lukaszewska M, Datsenko K, Jain I, Savitskaya E, Mallon J, Shmakov S, Bothner B, Bailey S, Yakunin A, Severinov K, Semenova E. Nucleic Acids Research, 2016, vol.44, №22, 10849-10861, doi: 10.1093/nar/gkw914

The Influence of Copy-Number of Targeted Extrachromosomal Genetic Elements on the Outcome of CRISPR-Cas Defense. Severinov K, Ispolatov I, Semenova E. Front. Mol. Biosci. 2016, 31 August | http://dx.doi.org/10.3389/fmolb.2016.00045

Diversity of CRISPR-Cas-Mediated Mechanisms of Adaptive Immunity in Prokaryotes and Their Application in Biotechnology. Savitskaya E, Musharova O, Severinov K. Biochemistry (Mosc). 2016 Jul;81(7):653-61. doi: 10.1134/S0006297916070026.

Highly efficient primed spacer acquisition from targets destroyed by the Escherichia coli type I-E CRISPR-Cas interfering complex. Semenova E, Savitskaya E, Musharova O, Strotskaya A, Vorontsova D, Datsenko K, Logacheva M, Severinov K. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016, 7626–7631, doi: 10.1073/pnas.1602639113.

C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Abudayyeh O, Gootenberg J, Konermann S, Joung J, Slaymaker I, Cox D, Shmakov S, Makarova K, Semenova E, Minakhin L, Severinov K, Regev A, Lander E, Koonin E, Zhang F. Science, 2016 Aug 5;353(6299):aaf5573pii: aaf5573.

The genome of AR9, a giant transducing Bacillus phage encoding two multisubunit RNA polymerases. Lavysh D, Sokolova M, Minakhin L, Yakunina M, Artamonova T, Kozyavkin S, Makarova K, Koonin E, Severinov K. Virology. 2016 May 26;495:185-196. doi: 10.1016/j.virol.2016.04.030.

Metagenomic Analysis of Bacterial Communities of Antarctic Surface Snow. Lopatina A, Medvedeva S, Shmakov S, Logacheva D, Krylenkov V, Severinov K. Front. Microbiol 2016. | doi: 10.3389/fmicb.2016.00398

Use of RNA polymerase molecular beacon assay to measure RNA polymerase interactions with model promoter fragments. Mekler V, Severinov K. Methods Mol Biol. 2015;1276:199-210. doi: 10.1007/978-1-4939-2392-2_11.

Bacteriophage Xp10 anti-termination factor p7 induces forward translocation by host RNA polymerase. Zenkin N, Severinov K, Yuzenkova Y. Nucleic Acids Res. 2015 Jun 1. pii: gkv586.

The Cas6e ribonuclease is not required for interference and adaptation by the E. coli type I-E CRISPR-Cas system. Semenova E, Kuznedelov K, Datsenko K, Boudry P, Savitskaya E, Medvedeva S, Beloglazova N, Logacheva M, Yakunin A, Severinov K. Nucleic Acids Res. 2015 May 26. pii: gkv546.

Rapid Multiplex Creation of Escherichia coli Strains Capable of Interfering with Phage Infection Through CRISPR. Strotksaya A, Semenova E, Severinov K. Methods Mol Biol. 2015;1311:147-59. doi: 10.1007/978-1-4939-2687-9_9.

RNA polymerase molecular beacon as tool for studies of RNA polymerase-promoter interactions. Mekler V, Severinov K. Methods. 2015 May 5. pii: S1046-2023(15)00180-2. doi: 10.1016/j.ymeth.2015.04.033.

Functional analysis of C1 family cysteine peptidases in the larval gut of Тenebrio molitor and Tribolium castaneum. Martynov A, Elpidina E, Perkin L, Oppert B. BMC Genomics. 2015 Feb 14;16:75. doi: 10.1186/s12864-015-1306-x.

Distinct pathways of RNA polymerase regulation by a phage-encoded factor. Esyunina D, Klimuk E, Severinov K, Kulbachinskiy A. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Feb 17;112(7):2017-22. doi: 10.1073/pnas.1416330112. Epub 2015 Feb 2.

Enzymatic Synthesis and Functional Characterization of Bioactive Microcin C-Like Compounds with Altered Peptide Sequence and Length. Bantysh O, Serebryakova M, Zukher I, Kulikovsky A, Tsibulskaya D, Dubiley S, Severinov K. J Bacteriol. 2015 Oct 1;197(19):3133-41. doi: 10.1128/JB.00271-15. Epub 2015 Jul 20.

A non-canonical multisubunit RNA polymerase encoded by a giant bacteriophage. Yakunina M, Artamonova T, Borukhov S, Makarova K, Severinov K, Minakhin L. Nucleic Acids Res. 2015 Dec 2;43(21):10411-20. doi: 10.1093/nar/gkv1095. Epub 2015 Oct 20

CRISPR interference and priming varies with individual spacer sequences. Xue C, Seetharam A, Musharova O, Severinov K, J Brouns S, Severin A, Sashital D. Nucleic Acids Res. 2015 Dec 15;43(22):10831-47. doi: 10.1093/nar/gkv1259. Epub 2015 Nov 19.

Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. Shmakov S, Abudayyeh O, Makarova K, Wolf I, Gootenberg J, Semenova E, Minakhin L, Joung J, Konermann S, Severinov K, Zhang F, Koonin EV. Mol Cell. 2015 Nov 5;60(3):385-97. doi: 10.1016/j.molcel.2015.10.008. Epub 2015 Oct 22.

Foreign DNA acquisition by the I-F CRISPR-Cas system requires all components of the interference machinery. Vorontsova D, Datsenko K, Medvedeva S, Bondy-Denomy J, Savitskaya E, Pougach K, Logacheva M, Wiedenheft B, Davidson A, Severinov K, Semenova E.Nucleic Acids Res. 2015 Dec 15;43(22):10848-60. doi: 10.1093/nar/gkv1261. Epub 2015 Nov 19.

Temporal dynamics of methyltransferase and restriction endonuclease accumulation in individual cells after introducing a restriction-modification system. Morozova N, Sabantsev A, Bogdanova E, Fedorova Y, Maikova A, Vedyaykin A, Rodic A, Djordjevic M, Khodorkovskii M, Severinov K. Nucleic Acids Res. 2015 Dec 19. pii: gkv1490.

Antibiotic streptolydigin requires non-catalytic Mg2+ for binding to RNA polymerase. Zorov S, Yuzenkova Y, Nikiforov V, Severinov K, Zenkin N. Antimicrob. Agents Chemother, 2014 58, 1420-1424.

CRISPR-Cas: Outstanding questions remain. Severinov K. Phys Life Rev. 2014, 11, 146-148,

The C-terminal unmodified part of microcin B is required for DNA gyrase inhibition and antibiotic entry into sensitive cells. Shkundina I, Serebryakova M, Severinov K Bacteriol. 2014, 196, 1759-1767..

Enzymatic synthesis of bioinformatically predicted microcin C-like compounds encoded by diverse bacteria. Bantysh O, Serebryakova M, Makarova K, Dubiley S, Datsenko K, and Severinov K. Mbio, 2014 5, е01059-14.. (2014)

Structural basis for RNA polymerase promoter specificity switching by a phage factor. Tagami S, Sekine S, Minakhin L, Esyunina D, Akasaka R, Shirouzu M, Kulbachinskiy A, Severinov K, Yokoyama S. 2014 28, 521-531

Development of giant bacteriophage фKZ is independent of host transcription apparatus Ceyssens, P.-J, Minakhin L, Van den Bossche A, Yakunina M, Klimuk E, Blasdel B, De Smet J, Noben J, Bläsi U, Severinov K. Lavigne R. J Virol , 2014 88, 10501-10510

Structural basis for promoter specificity switching of RNA polymerase by a phage factor. Tagami S, Sekine S, Minakhin L, Esyunina D, Akasaka R, Shirouzu M, Kulbachinskiy A, Severinov K, Yokoyama S.Genes Dev. 2014 Mar 1;28(5):521-31. doi: 10.1101/gad.233916.113.

The RimL transacetylase provides resistance to translation inhibitors microcin C and albomycin. Kazakov T, Kuznedelov K, Semenova E, Mukhamedyarov D, Datsenko K, Vondenhoff H, Tikhonov A, Agarwal V, Nair S, Van Aerschot V, Severinov K. J. Bacteriol, 2014 196, 3377-3385

Molecular basis of RNA polymerase promoter specificity switch revealed through studies of Thermus bacteriophage transcription regulator. Severinov K, Minakhin L, Sekine S-I, Lopatina A, Yokoyama S. Bacteriophage, 2014 4, е29399

Ribosome-controlled transcription termination is essential for production of antibiotic microcin C Zukher I, Novikova M, Tikhonov A, Nesterchuk M, Osterman I, Djordjevic M, Sergiev P, Sharma C, Severinov K. 2014 Nucleic Acids Res 2014., 42, 11891-11902

Research grants/Industry funded research

Транспортируемые аденоассоциированными вирусами нуклеазы для нового поколения препаратов генной терапии наследственных заболеваний

Соглашением о предоставлении субсидии № 075-10-2019-047 от 20 июня 2019 г. (14.606.21.0006 от 26 сентября 2017 г.) с МИНИСТЕРСТВОМ НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Предоставление гранта из федерального бюджета в форме субсидии на финансовое обеспечение реализации федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы», утвержденной постановлением Правительства Российской Федерации от 21 мая 2013 г. № 426 «О федеральной целевой программе «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы».

1. В рамках реализации Получателем мероприятия “Проведение прикладных научных исследований для развития отраслей экономики”

2. В целях достижения результата проекта по лоту шифр № 2017-14-576-0053 по теме: «Транспортируемые аденоассоциированными вирусами нуклеазы для нового поколения препаратов генной терапии наследственных заболеваний»

Шифр заявки «2017-14-576-0053-245»

Уникальный идентификатор проекта RFMEFI60617X0006

ИГК 0000000007519RVC0002

Руководитель проекта: Konstantin Severinov

Цель проекта.

CRISPR-Cas нуклеазы – это новый эффективный метод редактирования генома животных и человека. Изначально обнаруженные в клетках бактерий и архей, Cas белки представляют собой нуклеазы, способные специфически вносить двунитевые разрывы в участки ДНК. Специфическое распознавание целевой последовательности достигается за счет наличия направляющей РНК, последовательность которой комплементарна ДНК-мишени. Использование направляющих РНК разной последовательности позволяет легко нацеливать Cas нуклеазы на различные участки эукариотического генома. Эффективность работы и легкость использования сделали Cas –белки основными кандидатами для проведения генетической терапии человека.

Одной из основных задач на сегодняшний день является создание эффективного способа доставки генов белков в клетки взрослого человека. Аденоассоциированные вирусы (далее AAV) – эффективный и безопасный способ доставки генетического материала в клетки человека. AAV прошли ряд клинических испытаний на людях и показали свою незаменимость в медицинской практике. Однако емкость вирусного капсида не позволяет вмещать крупные Cas гены и таким образом, препятствует использованию AAV в качестве средства их доставки.

Целью данного проекта является поиск новых малоразмерных Cas нуклеаз и использование их для редактирования генома клеток человека.

В соответствии с Соглашением о предоставлении субсидии от 14.606.21.0006 от 26 сентября 2017 г. с Минобрнауки России (в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы») в период с 26.09.2017 по 29.12.2017 проведен первый этап прикладных научных исследований, в ходе которых выполнены следующие работы:

Этап 1.

Сделан аналитический обзор современной научно-технической и методической литературы по теме исследования.
Проведены патентные исследования.
Разработан алгоритм поиска нуклеаз известных классов и идентификации последовательностей, кодирующих отдельные нуклеазные домены известных типов.
Поведен биоинформатический поиск последовательностей нуклеазных доменов и малых нуклеаз известных классов в геномах бактерий.
Получен набор последовательностей генов нуклеаз, перспективных для редактирования генома.
Получена одна нуклеаза-кандидат и проведены ее исследовательские испытания на предмет определения механизмов их ферментативной (нуклеазной) активности в бактериальных клетках и in-vitro, а также их биохимическая характеризация.
Получены экспериментальные образцы AAV частиц (без гена нуклеазы) для исследовательских испытаний на предмет пригодности в качестве средства доставки гена нуклеазы в клетку человека.
Проведены исследовательские испытания AAV частиц на предмет стабильности, возможности заражения клеток (доставки).

Этап 2.

В течение второго этапа работ по проекту была проведена полная биохимическая характеризация новых Cas нуклеаз, найденных биоинформатическими методами в рамках работ первого этапа. Были проведены эксперименты с бакериальными культурами, несущими изучаемые CRISPR Cas системы, а также получены рекомбинантные формы белков и проведена их биохимическая характеризация in vitro. Результаты работ показали, что белки CcCas9, DsCas9, DfCas9 и PpCas9 являются активными нуклеазами, способными вносить двунитевые разрывы в ДНК. В ходе работ были определены характерные для этих нуклеаз PAM последовальности и вид направляющих РНК, необходимых для эффективной порезки ДНК-мишеней. CcCas9, DsCas9, DfCas9 и PpCas9 обоадают короткими, относительно простыми, удобными для использования PAM последовательностями.
Проверка активности нуклеаз в редактировании эукариотического генома показала способность DfCas9 и DsCas9 вносить разрывы в геномную ДНК. Эффективность этих белков а также белков CcCas9 и PpCas9 планируется улучшить элиминацией протеолитических сайтов в последовательностях белков, а также модификацией векторов и способа трансфекции, в связи с чем были начаты подготовительные работы.
В ходе второго этапа проекта был разработан проект лаборатрного регламента получения препарата для генной терапии миодистрофии Дюшенна. Кроме того были оптимизированы условия роста культуры миоцитов человека, а также получена культура миоцитов, несущая мутацию в DMD гене, которая будет служить модельной линией клеток для тестирования препарата.
По результатам работ были поданы две заявки на патенты, напечатано две публикации, а также обеспечено участие исполнителей проекта в ряде мероприятий, обеспечивающих освещение результатов ПНИ.
На следующем этапе проекта будет проверена специфичность разрабатываемых нуклеаз, а также проведены работы по созданию экспериментального образца препарата на основе вирусных AAV частиц и Cas нулеаз для лечения миодистрофии Дюшенна.

Таким образом в соответствии с Техническим заданием и календарным планом в 2018 году по этапу № 2 «Получение и исследовательские испытания экспериментальных образцов новых нуклеаз» были получены следующие результаты:

Разработаны программы и методики и проведены исследовательские испытания бактериальных культур, несущих новые системы, на предмет роста в различных условиях их культивирования, включая эксперименты по заражению чужеродными нуклеиновыми кислотами.
Получены экспериментальные образцы генетических конструкций для выделения и очистки исследуемых белков на основе синтетических последовательностей генов, кодирующих перпективные нуклеазы-кандидаты.
Получены экспериментальные образцы рекомбинатных форм 1-ой партии нуклеаз-кандидатов .
Разработаны программы и методики и проведены исследовательские испытания рекомбинатных форм 1-ой партии нуклеаз-кандидатов с целью их биохимической характеризации, включая исследовангия оп определению PAM последовательностей и последовательностей направляющих РНК.
Получены экспериментальные образцы рекомбинатных форм 2-ой партии нуклеаз-кандидатов.
Разработаны программы и методики и проведены исследовательские испытания рекомбинатных форм 1-ой партии нуклеаз-кандидатов с целью их биохимической характеризации включая исследовангия оп определению PAM последовательностей и последовательностей направляющих РНК.
Проведены работы по материально-техническому снабжению проекта.
Обеспечено участие в мероприятиях, направленных на освещение результатов ПНИ.
Разработаны схемы клонипрования генетических векторов и их получение для первичного тестирования нуклеаз-кандидатов в эукариотических клетках.
Разработаны программа и методики и проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов генетических векторов, кодирующие нуклеазы 1-ой партии в клектах человека на предмет оценки активности нуклеаз в редактировании эукариотического генома клеток HEK293 в генах Grin2b и VEGFA.
Разработаны программа и методики и проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов генетических векторов, кодирующие нуклеазы 2-ой партии в клектах человека на предмет оценки активности нуклеаз в редактировании эукариотического генома клеток HEK293 в генах Grin2b и VEGFA.
Выявлены основные нуклеазы-кандидаты, активные в клетках человека.
Была проведена корректировка генетических векторов по результатам исследовательских испытаний.
Разарботаны программа и методики и проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов генетических векторов, кодирующих нуклеазы-кандидаты в миоцитах человека на предмет оценки активности нуклеаз в редактировании мутаций в DMD гене.
Разработан проект лабораторного регламента получения препарата для генной терапии миодистрофии Дюшенна.
Получены экспериментальные образцы культуры миоцитов, несущей мутацию в DMD гене.
Разработаны программа и методики и проведены исследовательские испытания миоцитов человека на предмет эффективности роста в различных условиях их культвирования.

План работ в 2018 г. по этапу № 2 выполнен в соответствии с Техническим заданием и Календарным планом в полном объеме.

Этап 3.

В течение третьего этапа работ по проекту было показано, что нуклеаза PpCas9 является самым активным ферментом в клетках человека из охарактеризованных в течение 2018 года нуклеаз, при условии использования удлиненной направляющей РНК. Было показано, что геном-модифицирующая CRISPR-Cas система на основе этой малоразмерной нуклеазы упаковывается в `AAV капсид, а также продемонстрирована высокая специфичность PpCas9 системы в разрезании ДНК клеток человека. В связи с этим, на основе этой нуклеазы был создан препарат для редактирования мутаций, ведущих к наследственным заболеваниям, в частности к миодистрофии Дюшенна. Препарат представляет собой смесь AAV частиц, несущих CRISPR Cas систему и ген микродистрофина. Таким образом, в ходе проекта удалось создать систему редактирования генома на основе новой малоразмерной нуклеазы PpCas9. Результаты работ приняты в публикацию в том числе в высокорейтинговых журналах. На ряд результатов интеллектуальной деятельности получены согласия на выдачу патентов РФ.

Полученное средство редактирования генома человека может быть потенциально использовано для лечения наследственных заболеваний, таких как миодистрофия Дюшенна.

По результатам работ были поданы заявки на патенты: “СРЕДСТВО РАЗРЕЗАНИЯ ДНК НА ОСНОВЕ CAS9 БЕЛКА ИЗ БАКТЕРИИ PASTEURELLA PNEUMOTROPICA”, “СРЕДСТВО РАЗРЕЗАНИЯ ДНК НА ОСНОВЕ CAS9 БЕЛКА ИЗ БАКТЕРИИ DEMEQUINA SEDIMINICOLA” и “ПРИМЕНЕНИЕ CAS9 БЕЛКА ИЗ БАКТЕРИИ PASTEURELLA PNEUMOTROPICA ДЛЯ МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМНОЙ ДНК В КЛЕТКАХ”.

Индустриальный партнер проекта, компания Биокад, планирует использовать результаты проекта для создания средств редактирования мутаций в геноме клеток человека. На результаты работ поданы патентные заявки РФ, часть которых на данный момент согласована для получения патентов, остальные находятся на рассмотрении.

Engineering thermophage particles for studying virus assembly

Obtaining and biochemical characterization of Cas9 protein with CJSC

Identification of Key genetic/epigenetic Marker(s) in cervical carcinogenesis and development of corresponding Molecular Therapeutics for precision medicine of cervical cancer

Relationship between interference and adaptation during the action of Type I-E CRISPR-Cas system of Escherichia coli

Computational approach for discovery of new CRISPR-Cas associated proteins

Study of the mechanisms of foreign DNA recognition by bacterial defense system BREX from Escherichi coli HS

Delivery of New Nucleases by AAV for Gene Therapy of Hereditary Diseases

Study of the regulation of expression of the genes of the restriction-modification Kpn2I system

Skoltech Biomedical Initiative

Personalized bacteriophage therapy of clostridium Difficile Infections

Next Generation Program: Skoltech – MIT Joint Projects

Search and Development of New Genome Editing Tools for Biomedicine and Biotechnology

Skoltech Translational and Research Innovation Program – STRIP

Development of Personal Genetic Screening System

A Platform Approach to Develop New Antibiotic Leads Based on Microcins

Systems biology fellowship

Comprehensive characterization of CRISPR-linked genes

PhD 2019

MSc 2019

PhD 2018

MSc 2018

PhD 2017

MSc 2017

MSc 2016

Advanced Molecular Biology Laboratory Practice

Molecular Biology Seminar

Team:	Svetlana Dubiley	Daria Artamonova	Darya Tsibulskaya
Alexander Stepakov	Julia Piskunova	Darya Tsibulskaya	Alexey Kulikovsky
Natalia Morozova	Regina Tkach	Ivan Fedorov	Natalia Morozova
Ilya Mazunin	Eugene Lysenko	Alena Drobiazko	Nikita Shebanov



PhD Students:	Victor Mamontov	Iana Fedorova	Dmitry Sutormin
Daniel Vyhovskyi	Anna Shiriaeva	Dmitrii Travin	Artem Isaev
Darya Slonova	Ishita Jain	Julia Gordeeva	Elena Kurilovich
Alexandra Zazykina	Noemi Marco	Sofia Kamalyan	Karyna Karneyeva
Bogdan Kirillov	Matvei Kolesnik	Polina Muzyukina	Natalia Nikitchina
Alexander Polkhovskiy	Eldar Yagmurov

Yulia Zhitnyuk	Development of messenger RNA delivery platform via virus-like particles
Sofia Medvedeva	Natural diversity of CRISPR spacers
Anna Maikova	The CRISPR-Cas system of human pathogen Clostridium difficile: function and regulation
Tatyana Zyubko	Efficient in vivo synthesis of lasso peptide pseudomycoidin proceeds in the absence of leader and leader peptidase

Mariia Vlasenok	Regulation of genome-wide transcription by essential factors that control promoter-proximal RNA polymerase II pausing in human cells
Matvei Kolesnik	Matvei Kolesnik Konstantin Severinov Off-target degradation of cellular RNA by CRISPR-Cas13a nuclease: evidence of the involvement of RNA-targeting toxins
Alena Drobiazko	The Study of BREX System Proteins Functions
Karyna Karneyeva	A study of bacteriophage infection processes in the presence of Type III CRISPR-Cas mediated defense
Aleksandr Kirillov	The influence of copy number of restriction-modification genes on protection from viral infection
Valeriia Mitsurova	Studying the involvement of autophagy in the response of A. thaliana to M. persicae attack
Anastasiia Stepanova	Leafy head development of Chinese cabbage
Aleksandr Polkhovskii	Characterization of telomerase machinery components in Brassicaceae family
Sergei Bogomolov	Antimicrobial phytochemicals from edible and medicinal plants

Maria Sokolova	Functional and structural analysis of a non-canonical multisubunit RNA polymerase encoded by giant bacteriophage AR9
Andrey Krivoy	Primed CRISPR-Cas Adaptation in Type I-E System of Escherichia Coli: Use of Single-Molecule and Biochemical Assays to Verify Models of the Phenomenon at Molecular Level
Alexander Martynov	Using Mathematical Modeling to Understand Prokaryotic Adaptive Immunity
Anna Moroz	Preclinical Testing of New Modalities for PET Visualization and Treatment of RAS-Driven Cancers

Evgeniia Alekseeva	Adaptive Dynamics in Changing Environment
Elena Fomenko	Inhibition of Adoptation Escherichia coli Type I-E CRISPR-Cas by Phage Proteins
Julia Gordeeva	Mechanism of Defense Function of BREX System from Escherichia coli
Anastasia Grigoreva	A Novel Lantibiotic from Bacillus Thuringiensis: Structural and Functional Characteristics
Anton Krotov	New Post-translational Modifications of Lasso Peptides
Sofya Panafidina	Using Molecular Beacon Assay to Monitor Class 2 CRISPR Effectors Binding to Their Targets
Vasilisa Polinovskaya	Effects of Restriction-modification Systems Gene Copy Number on Protection from Phage Infection
Laura Elidedt Rodriguez Torres	Expression and Functional Characterization of Microcin C-like Compound Encoded by Marinomonas sp
Daria Titova	Interactions of Cas3 Nuclease with Target DNA During CRISPR Interference in vivo
Olga Tolicheva	Application of Acoustic Force Spectroscopy to Probe Protein Biosynthesis Machinery
Daria Treskova	The Role of Base Modifications in Accommodation of aminoacyl-tRNA During Ribosomal Decoding
Irina Utkina	The Origin and Features of Orphan CRISPR Arrays
Ivan Valiev	Finding Motifs in the Integrated Metabolism and Transcription Regulation Network of E.coli
Varvara Verkhova	Mechanisms of CRISPR-interference And Target Recognition by Thermus Thermophilus Type III-A and III-B CRISPR-Cas Systems

Sergey Shmakov	Computational approaches for discovery of novel CRISPR-Cas systems
Olga Musharova	Investigation of DNA-binding specificity of Cas1-Cas2 CRISPR adaptation complex in Escherichia coli
Aleksandra Strotskaya	Effects of targeting by Escherichia coli I-E CRISPR-Cas system on infection by different phages
Daria Artamonova	Comparative analysis of the action of eubacterial class 1 CRISPR-Cas systems
Julia Piskunova	Maturation and functional analysis of microcin C-like compounds

Artem Isaev	Study of BREX, novel bacteriophage resistance system
Nadezda Volovich	Characterization of methyltransferase MccD performing posttranslational modification of microcin C

Brendan Wilcox	Study of Yb12/Ybi13, a New Toxin-Antitoxin System Within E. coli
Andrey Krivoy	Magnetic tweezers as a method to study protein-DNA interactions on an example of type I-E E. coli CRISPR/Cas system